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菌落PCR是筛选重组子的有效方法，可以使质粒鉴定过程从两天缩短到几小时。但如果宿主是酵母，其菌落PCR的难点则是破壁，因为酵母的细胞壁比细菌坚韧许多。

• 破壁效率高，甚至可以用于野生型酵母。
  
• 既可用酵母菌落，也可用酵母培养液。
  
• 条件温和，菌落PCR可以扩增长达3kb的DNA。
  
• 既可小规模筛选，也适用于大规模筛查。
  
• 高灵敏度，既可用于扩增酵母质粒，也可以用于扩增酵母基因组DNA。
  
• PCR反应液中含有惰性电泳染料，反应后可直接上样电泳，不需另加上样液。
  
• 处理过的酵母菌落样品低温长期保存后仍能用于PCR筛查。
  
• 本制品足够100次60μL体系的酵母菌落PCR。

1. 如果有N个样本，则标记N+2个1.5mL的塑料离心管，N个用于样本，一个用于阳性对照PC（确认有质粒阳性的样本），一个用于阴性对照NC（可以用水代替）。
   
2. 在每个管中加入20μL酵母破壁液。
   
3. 挑入一个新鲜酵母菌落（芝麻大小即可）或2μL酵母饱和菌液。
   
4. 加入体积跟酵母破壁液相当的酸洗玻璃珠（重量在20～30mg）。
   
5. 涡旋震荡3分钟。
   
6. 常温10000rpm离心半分钟后可以直接取上清作为模板立即进行PCR。如果不立即进行PCR，需将上清全部转移到新离心管中（至少可以取出15μL），再加入等体积的自备TE缓冲液，放-20℃待用。TE缓冲液中的EDTA可以抑制样本中残留DNase的活性，可以使DNA的放置时间更长。

7. 在一个1.5mL的预冷塑料离心管中分别加入下列预冷成份并充分混匀，得到PCR预混液并放冰上待用。由于有N+2个样本，所以配制时多加一个，按N+3计算：
   

   成分	N+2个样品管
   自备超纯水	27μL×（N+3）
   自备PCR引物F(10μM)	1μL×（N+3）
   自备PCR引物R(10μM)	1μL×（N+3）
   2×PCR MasterMix	30μL×（N+3）
   合计	59μL×（N+3）

8. 将上步得到的预冷PCR预混液按59μL/管分装到N+2个标记并且预冷的PCR管中。
   
9. 将制备的N+2个样品各取1μL加入上步加有59μL混合液的PCR管中。PC样到PC管，NC样到NC管，1号样品加入到1号PCR管中，以此类推。由于裂解液含大量PCR抑制物，样本用量不要超过1.5μL，否则样本加得越多，PCR越容易被抑制。
   
10. 将N+2个预冷的PCR管快速放入PCR仪器中进行扩增，PCR温度参数根据引物和模板情况由客户自己预先确定。
    
11. PCR结束后直接取10μL电泳直接进行琼脂糖电泳分析。本试剂盒提供的PCR MasterMix中已经含有电泳示踪剂和促沉剂，故可以直接上样。橙黄色电泳染料的泳动速度对应于50bp的DNA，蓝色电泳染料的泳动速度对应于3～5kb的DNA。
    
12. 如果阴性对照NC有预期大小的扩增产物，则无论阳性对照PC和N个样本的结果如何，整个实验无效。说明环境污染，需要解决污染问题再继续。
    如果阳性对照PC没有预期大小的片段，且没有任何样本呈现阳性，则很可能是试剂、程序、引物、仪器等有问题，需要解决问题后再继续。
    如果有任何一个样本呈现阳性（不包括阴性对照），则实验有效，可以继续分析每个样品。
    
13. 如果阳性对照有预期大小的片段，阴性对照没有，则整个实验有效。可以分析每个样品。每个样品如果有预期大小的扩增产物，则初步判断为阳性。如果没有，则判断为阴性。
    
14. 对阴性样本，可以用超纯水将其稀释10倍、百倍、千倍、万倍4个稀释度，然后一起再进行PCR检测，如果某个稀释度的样本出现预期扩增产物，则测试时需要先将样本稀释到该稀释度后再测。
    
15. 可以将阳性样品对应的菌落再挑出来进行培养并进行进一步的分析。